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试剂盒检测法

α-地中海贫血基因检测(缺失型)

α-地中海贫血(简称α-地贫)是一种由于α-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病,多由α-珠蛋白基因的缺失突变所致,是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。

【检验原理】本方法主要应用跨跃断裂点PCR(Gap-PCR)的技术原理进行检测,即在待检的缺失基因片段两端设计引物进行扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳,根据电泳片段大小判断检测样品的基因型,可同时检测3种(--SEA、-α3.7、-α4.2)缺失型α-地贫。

【检验方法】

1.DNA获取:一般可用实验室常规方法或试剂盒提取人基因组DNA;

2.PCR扩增:按体系加入PCR反应液和待测样品DNA;设置阴性质控,以纯水为模板,作为空白对照;设置阳性质控,所检测的4个条带(3个缺失和1个正常条带)中,任何一个临床样品的电泳结果应至少有一个条带,否则为实验失败。

扩增程序:96℃,15min;98℃,45s,64℃,90s,72℃,3min,35循环;72℃,5min。

3.电泳检测:取5ul扩增产物加入1ul 6×溴酚蓝上校缓冲液,经1.2%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束,将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统观察结果。

4.电泳条带与基因型的对应关系

基因型
条带大小
基因型
条带大小
3.7
2051bp
4.2
1645bp
αα
1826bp
--SEA
1306bp

β-地中海贫血基因检测(点突变)

β-地中海贫血(简称β-地贫)是一种由于β-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病,多由β-珠蛋白基因点突变所致,是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。本法检测41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、27/28M、43M、-29M、31M、-32M、-30M、14-15M、CAPM、IntM、IVS-I-5M。

【检验原理】PCR和DNA反向点杂交。设计特异的PCR引物且其5’端用生物素进行标记,扩增获得一定长度的DNA片段,该片段包含了所要检测的各个位点。根据检测位点碱基差异,按照碱基互补配对原则,设计特异性识别某种基因的寡核苷酸探针组合,分别固定在尼龙膜的特定位置上,制成检测膜条。PCR扩增产物与探针通过分子杂交反应及显色反应,观察检测膜条上各位点信号的有无(信号为蓝色斑点),判断该探针是否与PCR产物杂交,从而确定待检样品的基因型。

【检验方法】

1.DNA获取:一般可用实验室常规方法或试剂盒提取人基因组DNA;

2.PCR扩增:按体系加入PCR反应液和待测样品DNA;设置阴性质控,以纯水为模板,作为空白对照。

扩增程序:50℃,15min;95℃,10min;94℃,1min,55℃,30s,72℃,30s,35循环;72℃,5min。

3.杂交:取15ml离心管,放入标有样品编号的膜条,加入A液(2×SSC,0.1%SDS)及PCR产物,置于沸水浴中加热10分钟后放入42℃杂交箱中杂交1.5-4小时。

4.洗膜:取出膜条,移至装有预热B液(0.5×SSC,0.1%SDS)的容器中于42℃轻摇洗涤15分钟。

5.显色:用A液:POD=2000:1配制孵育液,室温轻摇孵育30分钟后用A液室温轻摇洗两次,每次5分钟,再用C液(0.1M柠檬酸钠)室温洗膜1-2分钟。同时配显色液(新鲜配制使用,按顺序加入以下溶液:C液 19ml,TMB 1ml,30%H2O2 2ul)。将膜条浸泡于显色液中避光显色5-20分钟即可观察结果。

6.结果说明

41-42N
654N
-28N
71-72N
17N
βEN
31N
27/28M
41-42M
654M
-28M
71-72M
17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M
-29M
-30M
14-15M
CAPM
IntM
IVS-I-5M

注:以上位点最后一个字母“N”代表正常,“M”代表突变。


α-地中海贫血基因检测(点突变)

中国人群中常见的α-地中海贫血基因突变类型主要为--SEA、-α3.7、-α4.2 3种缺失型,除此之外,还有αCS、αQS、αWS>三种点突变。

【检验原理】PCR和DNA反向点杂交。设计特异的PCR引物且其5’端用生物素进行标记,扩增获得一定长度的DNA片段,该片段包含了所要检测的各个位点。根据检测位点碱基差异,按照碱基互补配对原则,设计特异性识别某种基因的寡核苷酸探针组合,分别固定在尼龙膜的特定位置上,制成检测膜条。PCR扩增产物与探针通过分子杂交反应及显色反应,观察检测膜条上各位点信号的有无(信号为蓝色斑点),判断该探针是否与PCR产物杂交,从而确定待检样品的基因型。

【检验方法】

1.DNA获取:一般可用实验室常规方法或试剂盒提取人基因组DNA;

2.PCR扩增:按体系加入PCR反应液和待测样品DNA;设置阴性质控,以纯水为模板,作为空白对照。

扩增程序:50℃,15min;95℃,10min;95℃,45min,64℃,2min,15循环;95℃,30s,49℃,30s,72℃,30s,30循环;72℃,5min。

3.杂交:取15ml离心管,放入标有样品编号的膜条,加入A液(2×SSC,0.1%SDS)及PCR产物,置于沸水浴中加热10分钟后放入48℃杂交箱中杂交1.5-4小时。

4.洗膜:取出膜条,移至装有预热B液(0.5×SSC,0.1%SDS)的容器中于48℃轻摇洗涤15分钟。

5.显色:用A液:POD=2000:1配制孵育液,室温轻摇孵育30分钟后用A液室温轻摇洗两次,每次5分钟,再用C液(0.1M柠檬酸钠)室温洗膜1-2分钟。同时配显色液(新鲜配制使用,按顺序加入以下溶液:C液 19ml,TMB 1ml,30%H2O2 2ul)。将膜条浸泡于显色液中避光显色10-30分钟即可观察结果。

6.结果说明

QSN
CSN
WSN
QSM
CSM
WSM

注:QSN、CSN、WSN分别代表αQSα、αCSα、αWSα正常对照位点;QSM、CSM、WSM分别代表αQSα、αCSα、αWSα突变位点。